27. BOLUMENA, 3. ALEA • 2023ko urria. Ale osoa »
Junior Saria - Oinarrizko Zientzia
IP-RT-QuIC-ek gaixotasun espezifikoetarako alfa-sinukleina haziak identifikatzen ditu sinukleinopatia duten pazienteen serumean.
Odolaren bidezko bide batek α-sinukleina agregazio anormala hedatzean duen inplikazio potentziala ikertzen
Ohore handia sentitzen dut MDS Junior Ikerketa Saria jasotzeagatik eta eskertuta nago gure ikerketa MDS komunitatearekin nazioarteko konferentzia batean partekatzeko aukera izateagatik. Proiektu hau ez litzateke posible izango nire lankidearen eta ikertzaile laguntzaileen ahaleginik gabe, eta haiei bihotzez eskertzen diet.
α-sinukleinaren agregazio anormala sinukleinopatien ezaugarri patologiko gakoa da, Parkinson gaixotasuna (PD), Lewy gorputzak dituen dementzia (DLB) eta sistema anitzeko atrofia (MSA) barne hartzen dituzten neuroendekapenezko gaixotasunen talde bat. Azken ikerketek frogatu dute gaixotasun hauek ez dutela garuna bakarrik inplikatzen, baita nerbio periferikoak ere, eta horrek hipotesi batera eraman du: odol-bide batek α-sinukleinaren hedapen sistemikoan parte hartu dezake. Galdera honi erantzuteko, serumean α-sinukleina agregatuaren arrastoak detektatzeko metodo bat garatu dugu, prioi gaixotasunen diagnostikoan erabiltzen den Denbora Errealeko Dardarak eragindako Bihurketa (RT-QuIC) metodoa aldatuz. Bizkor-muineko likidoan (LZE) oinarritutako RT-QuIC metodoak existitzen diren arren, bizkarrezur-muineko zulaketa inbaditzailea, teknikoki erronka handikoa eta denbora asko eskatzen duena da, eta askotan prozedura osteko buruko minak eragiten ditu. Beraz, zaila da ikuspegi hau kasu guztietan aplikatzea.
Sinukleinopatietan, α-sinukleina agregatu patologikoek txantiloi gisa joka dezakete α-sinukleina normal endogenoa forma patologiko bihurtzeko. Hala ere, odoleko α-sinukleina mailak oso baxuak dira, eta horrek detekzioa zailtzen du. RT-QuIC-ren sentikortasuna hobetzen saiatu ginen sinukleinopatia duten pazienteen serumean zirkulatzen duten α-sinukleina agregatu anormalen arrastoak detektatzeko. Immunoprezipitazioa (IP) egin genuen, eta ondoren RT-QuIC, horrela in vitro proteina-egitura anormalak anplifikatuz, agregazio-erreakzioetarako hazi gisa erabiliz. Anplifikazioa denbora errealean kontrolatu genuen Tioflavina T (ThT) fluoreszentzia-intentsitatea neurtuz, β-xafla-egiturak lotura espezifikoaren bidez markatuz.
Prioi gaixotasunen diagnostikoan, LKE zuzenean hazi gisa erabiltzen da. Hala ere, inolako tratamendurik gabeko odol-laginak erabiltzeak ez zuen RT-QuIC bidez gaizki tolestutako proteina detektatzea lortu. Hori dela eta, IP egin genuen pazienteen odol-laginetan ale magnetikoak erabiliz. α-sinukleina aurkako antigorputz bat (MJFR1) erabili genuen α-sinukleina kontzentratzeko. Anplifikazio-erreakzioak bi etapa izan zituen: 1) erreakzio-nahasketaren inkubazioa IP-serumarekin, α-sinukleina osasuntsuaren eta gaizki tolestutakoaren koagregazioa ahalbidetzeko, eta 2) osasuntsutik gaizki tolesturako bihurketa sustatzea, ThT bidez detektatua. Erreakzio-baldintzak optimizatu genituen 260,000 RFU-ko fluoreszentzia-intentsitate maximoa lortzeko, kontrol-parte-hartzaile osasuntsuen eta pazienteen arteko bereizketa ahalbidetuz.
Ikerketa honetan, α-sinukleinopatia zuten 270 paziente ikertu genituen, α-sinukleinopatiarik gabeko 55 paziente, kontrol-talde osasuntsuko 128 parte-hartzaile, Parkinekin lotutako PD (PRKN) duten 17 paziente eta REM loaren portaera-nahasmendua (RBD) duten bederatzi paziente. IP/RT-QuIC erabiliz, α-sinukleina haziaren presentzia nabarmen handiagoa detektatu genuen α-sinukleinopatia taldeetan. Gure Hartzaileen Eragiketa Ezaugarrien analisiak metodo honen diagnostiko-ahalmen handia berretsi zuen. Diagnostikoa patologikoki baieztatu zitekeen kasuetan, Lewy gorputzen gaixotasuna, MSA eta kontrol-detekzio-tasak % 100, % 33 eta % 0 izan ziren, hurrenez hurren. Luxenburgoko Unibertsitatearekin egindako lankidetza-ikerketa batean, PD eta MSA zuten 20 eta 15 pazienteren serum-laginak barne, hurrenez hurren, baita 20 kontrol-partaiderenak ere, gaizki tolestutako α-sinukleina haziaren detekzio-tasak % 75, % 53 eta % 5.0 izan ziren, hurrenez hurren.
Gainera, gure mikroskopio elektronikoaren irudiek α-sinukleina agregatu anplifikatuen egitura desberdinak agerian utzi zituzten PD/DLB eta MSA-n. Agregatu hauen propietateak ere aztertu genituen txantiloi gisa zelula landuetan. Agregatu mota desberdinak behatu ahal izan genituen, gaixotasun espezifikoen diagnostikorako potentziala iradokiz. Azkenik, pazienteen serumetik eratorritako α-sinukleina haziak anplifikatuak sagu basatien estriatuan injektatu genituen. Emaitzek iradoki zuten hazi hauek gaixotasun espezifikoen patologiak eragiteko gaitasuna mantentzen zutela.
Hala ere, IP/RT-QuIC metodoak mugak ditu, besteak beste, substratu-multzoen arteko ereiteko gaitasunean dagoen aldakortasuna eta parametro aldakorrak (T1/2, T max, etab.) direla eta ebaluazio kuantitatiboko zailtasunak lagin bera erabiltzean ere. Beraz, etorkizuneko ikerketa-ahaleginak ikuspegiaren egonkortasuna eta kuantifikagarritasuna hobetzera bideratu beharko lirateke. Horrez gain, detekzio-sentsibilitatea hobetzea beharrezkoa izango litzateke RBD bezalako baldintza pre-sintomatikoak identifikatzeko. Gaixotasunen arteko agregazio-egituren desberdintasunetan arreta jarriz, azpiko patogenia argitzea ere dugu helburu.